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Real Decreto 2611/1996, de 20 de diciembre, por el que se regulan los programas nacionales de erradicación de enfermedades de los animales. | |
Artículo 43. Infracciones y sanciones.
En el caso de incumplimiento de lo dispuesto en este Real Decreto, será de aplicación el régimen de infracciones y sanciones establecido en la Ley 8/2003, de 24 de abril, de sanidad animal, sin perjuicio de las posibles responsabilidades civiles, penales o de otro orden que pudieran concurrir.
DISPOSICIÓN ADICIONAL ÚNICA. Carácter básico.
Lo dispuesto en el presente Real Decreto tendrá carácter de normativa básica estatal, al amparo de lo dispuesto en el artículo 149.1.16 de la Constitución que atribuye al Estado la competencia en materia de bases y coordinación general de la sanidad.
DISPOSICIÓN TRANSITORIA PRIMERA. Plazo para la vacunación de la brucelosis bovina.
A partir de la entrada en vigor del presente Real Decreto se concede un plazo de doce meses para el cumplimiento de lo establecido en el apartado 1 del artículo 14, en lo referente a la vacunación de la brucelosis bovina.
DISPOSICIÓN TRANSITORIA SEGUNDA. Plazo máximo para el traslado de bovinos no afectados por la tuberculosis y brucelosis a otras Comunidades Autónomas.
No obstante lo dispuesto en el párrafo a de los artículos 19 y 24, y en el párrafo a del apartado 1 de los artículos 22 y 27, los órganos competentes de las Comunidades Autónomas podrán autorizar, hasta el 31 de diciembre de 2003, previo aislamiento de los animales sospechosos y sacrificio de los reaccionantes positivos de tuberculosis y brucelosis, el movimiento de los otros bovinos procedentes de la explotación afectada, siempre y cuando su destino sea exclusivamente una única explotación de engorde para su posterior traslado a matadero, previa comunicación a la Comunidad Autónoma de destino.
DISPOSICIÓN TRANSITORIA TERCERA. Movimiento de reses de lidia dentro del territorio nacional.
DISPOSICIÓN TRANSITORIA CUARTA. Vacunación contra la brucelosis.
1. Sin perjuicio de lo dispuesto en el artículo 14.1, hasta el 31 de diciembre de 2010 podrá autorizarse, como excepción en lo referente a la brucelosis bovina, cuando la situación epidemiológica de la enfermedad valorada en cada región así lo aconseje, la vacunación de hembras, en determinadas áreas o explotaciones, con la vacuna RB-51 respecto de la infección con brucella abortus, o con la vacuna REV-1 respecto de la infección con brucella melitensis.
2. Los órganos competentes de las comunidades autónomas que deseen acogerse a estas excepciones lo someterán a la aprobación del Comité Nacional del Sistema de Alerta Sanitaria Veterinaria regulado en el Real Decreto 1440/2001, de 21 de diciembre, por el que se establece el sistema de alerta sanitaria veterinaria, en función de la competencia que le corresponde según lo establecido en el artículo 5 de dicho Real Decreto.
3. Las condiciones para dicha vacunación serán, sin perjuicio de las derivadas, en su caso, de la autorización de comercialización de la vacuna de que se trate, las siguientes:
El almacenamiento, suministro, distribución y entrega de las vacunas se realizará exclusivamente bajo control de los órganos competentes de las comunidades autónomas.
La distribución de las vacunas antibrucelares se realizará exclusivamente y con carácter gratuito por los órganos competentes de las comunidades autónomas, de lotes oficialmente contrastados por el Centro Nacional de Referencia para la brucelosis en animales, y queda prohibida fuera de los laboratorios fabricantes su tenencia, comercialización y venta.
Todos los lotes de las vacunas antibrucelares producidas por entidades situadas en el territorio español deberán estar contrastadas por el Centro Nacional de Referencia para brucelosis en animales. Si tras la contrastación de dichos lotes de vacunas el dictamen fuera no apto, se procederá a su destrucción bajo supervisión oficial.
Los animales vacunados deberán ser marcados de forma que en todo momento se disponga, como mínimo, de su identificación y de la fecha de vacunación.
Las vacunas sólo podrán ser utilizadas por veterinarios oficiales o autorizados en el marco de un programa de erradicación de brucelosis bovina aprobado por la Comisión Europea de acuerdo con el artículo 24 de la Decisión del Consejo 90/424/CEE.
Los órganos competentes de las comunidades autónomas informarán periódicamente y de modo detallado al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, para su envío a la Comisión de la Unión Europea y al resto de Estados miembros, respecto del programa de vacunación, en particular del área de vacunación, de la edad de los animales vacunados y del sistema que se aplique para la identificación de los animales vacunados.
En la base de datos SIMOGAN se marcará a los animales vacunados.
Los órganos competentes de las comunidades autónomas velarán porque los animales vacunados no sean objeto de comercio intracomunitario, en particular mediante la aplicación de métodos adicionales de marcaje y registro de dichos animales.
Los órganos competentes de las comunidades autónomas velarán por que, hasta que transcurran dos años desde la última vacunación de los animales, en lo que se refiere al movimiento dentro del territorio nacional, los animales vacunados únicamente puedan tener los siguientes movimientos, y quedan prohibidos el resto:
Con destino directo a otra explotación en la que se haya vacunado también a las hembras de la especie bovina con la vacuna RB-51 para la brucella abortus, o con la vacuna Rev-1 para la brucella melitensis, o con destino directo a municipios o áreas geográficas en que se haya vacunado a las hembras de la especie bovina con dichas vacunas y el sistema de explotación sea mayoritariamente extensivo con aprovechamiento común de pastos, siempre y cuando, asimismo, en ambos casos, se hayan realizado a los animales, con carácter previo al movimiento, dos pruebas contra la brucelosis, separadas por seis meses, con resultados favorables.
Con destino directo a cebadero.
Con destino directo a matadero.
Los órganos competentes en materia de sanidad animal de las comunidades autónomas informarán a los órganos competentes en materia de salud pública de la respectiva comunidad acerca del uso de las vacunas y de los sistemas disponibles de diagnóstico y terapéuticos que se apliquen.
DISPOSICIÓN TRANSITORIA QUINTA. Movimiento de animales de explotaciones del tipo M3.
Hasta el 31 de diciembre de 2005, y para el movimiento dentro de España, los ovinos o caprinos vacunados de edad inferior a dos años, procedentes de explotaciones del tipo M3, podrán acceder a ferias y mercados calificados, siempre que cumplan el resto de condiciones sanitarias exigibles, y estén identificados individualmente de acuerdo con lo dispuesto en el artículo 4.1.a del Real Decreto 2121/1993, de 3 de diciembre, relativo a las normas de policía sanitaria que regulan los intercambios intracomunitarios y las importaciones de terceros países de animales de las especies ovina y caprina.
DISPOSICIÓN DEROGATORIA ÚNICA. Derogación normativa.
Queda derogadas las siguientes disposiciones:
El capítulo XVII del título II del Decreto de 4 de febrero de 1955, por el que se aprueba el Reglamento de Epizootías.
La Orden de 25 de noviembre de 1978 por la que se establecen normas para el desarrollo de campañas de saneamiento ganadero.
La Orden de 28 de febrero de 1986 por la que se establecen normas para el desarrollo de las campañas de saneamiento ganadero, así como las Órdenes de 1 de febrero de 1990 y de 1 de diciembre de 1992, que la modifican.
La Orden de 3 de febrero de 1987 por la que se establecen normas complementarias para el desarrollo de campañas de saneamiento contra la leucosis bovina enzoótica.
La Orden de 9 de febrero de 1990 por la que se establecen medidas complementarias en campañas de saneamiento ganadero.
La Orden de 19 de febrero de 1991 por la que se establecen normas en campañas de saneamiento ganadero, para la erradicación de la brucelosis en el ganado ovino y caprino.
Asimismo, quedarán derogadas cuantas disposiciones de igual o inferior rango se opongan a lo dispuesto en este Real Decreto.
DISPOSICIÓN FINAL PRIMERA. Facultad de desarrollo.
Se faculta al Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación para dictar las disposiciones necesarias para el cumplimiento de lo dispuesto en el presente Real Decreto y, en particular, para modificar los anexos.
DISPOSICIÓN FINAL SEGUNDA. Entrada en vigor.
El presente Real Decreto entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el Boletín Oficial del Estado.
Dado en Madrid a 20 de diciembre de 1996.
- Juan Carlos R. -
La Ministra de Agricultura, Pesca y Alimentación,
Loyola de Palacio del Valle-Lersundi.
1. Identificación del agente.
La presencia de Mycobacterium bovis (M. bovis), agente de la tuberculosis bovina, en muestras clínicas y de autopsia puede demostrarse examinando frotis teñidos o mediante técnicas de inmunoperoxidasa y confirmarse mediante cultivo del organismo en medio de aislamiento primario.
El material patológico para la confirmación de M. bovis debe tomarse de ganglios linfáticos anormales y órganos parenquimatosos, como los pulmones, el hígado, el bazo, etc. Cuando el animal no presente lesiones patológicas, deberán recogerse muestras de los ganglios linfáticos retrofaríngeos, bronquiales, mediastínicos, supramamarios y mandibulares, así como de algunos ganglios linfáticos mesentéricos y del hígado, para su examen y cultivo.
La identificación de las cepas aisladas podrá realizarse habitualmente determinando las propiedades bioquímicas y de cultivo. También podrá emplearse la reacción en cadena de la polimerasa para la detección del complejo de M. tuberculosis. Las técnicas de análisis del ADN pueden resultar más rápidas y fiables que los métodos bioquímicos para la diferenciación de M. bovis de otros miembros del complejo de M. tuberculosis. La huella genética permite distinguir entre diferentes cepas de M. bovis y posibilitará la descripción de patrones del origen, transmisión y propagación de M. bovis.
Las técnicas y medios utilizados, su normalización y la interpretación de los resultados deben ajustarse a los que se precisan en el capítulo 2.3.3 (tuberculosis bovina) de la cuarta edición (2000) del Manual de normas para las pruebas de diagnóstico y las vacunas de la OIE.
2. Intradermotuberculinización.
Los derivados proteínicos purificados de la tuberculina que cumplan las normas establecidas en el apartado 2.1 se utilizarán para realizar la intradermotuberculinización oficial con arreglo a los procedimientos mencionados en el apartado 2.2.
2.1 Normas aplicables a la tuberculina (bovina y aviar).
2.1.1 Definición.
El derivado proteínico purificado de la tuberculina (bovina o aviar) es un preparado que se obtiene, previo calentamiento, de productos del crecimiento y la lisis de Mycobacterium bovis o Mycobacterium avium (M. avium), según corresponda, capaz de poner de manifiesto hipersensibilidad retardada en un animal sensibilizado a los microorganismos de la misma especie.
2.1.2 Producción.
Se obtiene a partir de fracciones hidrosolubles preparadas calentando en vapor libre y filtrando posteriormente cultivos de M. bovis o M. avium (según corresponda) en un medio líquido sintético.
La fracción activa del filtrado, consistente principalmente en proteínas, se aísla mediante precipitación, se lava y se vuelve a disolver. Puede añadirse un conservante antimicrobiano que no produzca reacciones positivas falsas, como el fenol. La preparación estéril final, libre de micobacterias, se distribuye asépticamente en recipientes de vidrio inviolables que se cierran después para evitar que se contaminen. El preparado puede liofilizarse.
2.1.3 Identificación del producto.
Inyectar por vía intradérmica en puntos diferentes varias dosis graduadas a cobayas albinos sensibilizados convenientemente, cada uno de los cuales debe pesar al menos 250 g. Al cabo de un período de 24 a 28 horas, se producen reacciones en forma de hinchazones edematosas con eritema, acompañadas o no de necrosis en el punto de inyección. El tamaño e importancia de las reacciones varía de acuerdo con la dosis. Los cobayas que no se hayan sensibilizado no presentan reacción a inyecciones de este tipo.
2.1.4 Pruebas.
2.1.4.1 pH: el pH debe oscilar entre 6,5 y 7,5.
2.1.4.2 Fenol: si el preparado que vaya a examinarse contiene fenol, su concentración no debe ser superior a 5 g/l.
2.1.4.3 Efecto sensibilizante: emplear un grupo de tres cobayas que no hayan sido tratados con ningún material que pueda interferir con la prueba. En tres ocasiones, a intervalos de cinco días, inyectar por vía intradérmica a cada cobaya una dosis del preparado que se vaya a examinar, equivalente a 500 UI en 0,1 ml. Entre 15 y 21 días después de la tercera inyección, inyectar la misma dosis (500 UI) por vía intradérmica a esos animales y a un grupo de control de tres cobayas del mismo peso a los que no se les haya inyectado previamente tuberculina. Entre 24 y 28 horas después de las últimas inyecciones, las reacciones de los dos grupos no son muy diferentes.
2.1.4.4 Toxicidad: emplear dos cobayas, cada uno de los cuales debe pesar al menos 250 g, que no hayan sido tratados previamente con ningún material que pueda interferir con la prueba. Inyectar por vía subcutánea a cada animal 0,5 ml del preparado que se vaya a examinar. Observar los animales durante siete días. En el período de observación no se producen efectos anormales.
2.1.4.5 Esterilidad: se debe cumplir la prueba de esterilidad prescrita en la monografía sobre vacunas de uso veterinario de la cuarta edición (2002) de la Farmacopea Europea.
2.1.5. Actividad.
La actividad del derivado proteínico purificado de la tuberculina (bovina y aviar) se determina comparando las reacciones producidas en cobayas sensibilizados mediante la inyección intradérmica de una serie de diluciones del preparado que se vaya a examinar con las producidas por concentraciones conocidas de un preparado de referencia de derivado proteínico purificado de tuberculina (bovina o aviar, según corresponda), calibrado en unidades internacionales.
Para probar la actividad, sensibilizar como mínimo nueve cobayas albinos, cada uno de los cuales debe pesar entre 400 y 600 g, mediante una inyección intramuscular profunda de 0,0001 mg de masa húmeda de M. bovis vivo de la cepa AN5, suspendida en 0,5 ml de una solución de 9 g/l de cloruro de sodio R, en el caso de la tuberculina bovina, o una dosis adecuada de M. avium inactivado o vivo, en el de la tuberculina aviar. Transcurridas al menos cuatro semanas tras la sensibilización de los cobayas, afeitar los costados de los animales para disponer de espacio para un máximo de cuatro puntos de inyección en cada lado. Preparar diluciones del preparado que se vaya a examinar y del preparado de referencia utilizando una solución salina isotónica amortiguadora de fosfatos (pH 6,5 - 7,5) que contenga 0,005 g/l de polisorbato 80 R. Utilizar al menos tres dosis del preparado de referencia y otras tantas del preparado que vaya a examinarse. Escoger las dosis de modo que las lesiones producidas tengan un diámetro comprendido entre 8 y 25 mm. Distribuir aleatoriamente las diluciones entre los puntos valiéndose de un cuadrado latino. Inyectar cada dosis intradérmicamente en un volumen constante de 0,1 o 0,2 ml. Transcurridas entre 24 y 28 horas, medir los diámetros de las lesiones y calcular el resultado de la prueba utilizando los métodos estadísticos habituales, basándose en el supuesto de que los diámetros de las lesiones son directamente proporcionales al logaritmo de la concentración de las tuberculinas.
La prueba no será válida a menos que los límites de error (con una confianza P = 0,95) estén entre el 50 y el 200 % de la actividad calculada. La actividad calculada estará entre el 66 y el 150 % de la actividad declarada de la tuberculina bovina. La actividad calculada estará entre el 75 y el 133 % de la actividad declarada de la tuberculina aviar.
La actividad declarada será al menos igual a 20000 UI/ml para ambas tuberculinas (bovina y aviar).
2.1.6 Almacenamiento.
Almacenar al abrigo de la luz, a una temperatura de 5 ± 3 ºC.
2.1.7 Etiquetado.
La etiqueta debe indicar:
La actividad en unidades internacionales por mililitro.
El nombre y la cantidad de las eventuales sustancias añadidas.
En el caso de preparados liofilizados:
El nombre y volumen del líquido reconstituyente que debe añadirse.
Que el producto debe utilizarse inmediatamente después de la reconstitución.
2.2 Procedimientos de prueba.
2.2.1 Se considerarán intradermotuberculinizaciones oficiales:
La intradermotuberculinización sencilla: esta prueba requiere una única inyección de tuberculina bovina.
La intradermotuberculinización de comparación: esta prueba requiere una inyección de tuberculina bovina y una inyección de tuberculina aviar, administradas simultáneamente.
2.2.2 La dosis de tuberculina inyectada será:
Igual o superior a 2000 UI de tuberculina bovina.
Igual o superior a 2000 UI de tuberculina aviar.
2.2.3 El volumen de cada inyección no rebasará los 0,2 ml.
2.2.4 Las tuberculinizaciones se realizarán inyectando tuberculina en la piel del cuello. Los puntos de inyección estarán situados en el límite de los tercios anterior y medio del cuello. Cuando se inyecte tuberculina aviar y bovina al mismo animal, el punto de inyección de la tuberculina aviar estará situado a unos 10 cm del borde superior del cuello y el de la tuberculina bovina, unos 12,5 cm más abajo en una línea aproximadamente paralela a la del hombro o en lados diferentes del cuello; tratándose de animales jóvenes en los que no haya espacio para separar suficientemente los puntos de inyección en un lado del cuello, se administrará una inyección a cada lado del cuello en puntos idénticos, en el centro del tercio medio de éste.
2.2.5 La técnica de la tuberculinización y la interpretación de las reacciones serán las siguientes:
2.2.5.1 Técnica.
Los puntos de inyección se rasurarán y limpiarán. En cada zona rasurada se tomará un pliegue de piel entre el índice y el pulgar, se medirá con un compás y se anotará el resultado. A continuación se inyectará la dosis de tuberculina siguiendo un método que garantice que aquélla se administra intradérmicamente. Podrá utilizarse una aguja corta estéril, con la parte biselada hacia fuera, de una jeringuilla graduada que contenga tuberculina, que se insertará oblicuamente en las capas más profundas de la piel. Para confirmar si una inyección se ha efectuado correctamente deberá palparse una hinchazón del tamaño de un guisante en cada punto de inyección. El grosor del pliegue de piel de cada punto de inyección se medirá de nuevo 72 horas (+/- 4 h) después de la inyección y se anotará el resultado.
2.2.5.2 Interpretación de las reacciones.
La interpretación de las reacciones se basará en observaciones clínicas y en el aumento de grosor de los pliegues de piel en los puntos de inyección, anotados 72 horas después de haber inyectado la tuberculina.
Reacción negativa: sólo se observa una hinchazón limitada, con un aumento del grosor del pliegue de piel no superior a 2 mm, sin signos clínicos tales como edema difuso o extensivo, exudación, necrosis, dolor o inflamación de los conductos linfáticos de esa región o de los ganglios linfáticos.
Reacción dudosa: no se observa ninguno de los signos clínicos mencionados en el párrafo a y el aumento de grosor del pliegue de piel es superior a 2 mm e inferior a 4.
Reacción positiva: se observan signos clínicos de los mencionados en el párrafo a o el grosor del pliegue de piel del punto de inyección aumenta 4 mm o más.
2.2.5.3 La interpretación de las intradermotuberculinizaciones oficiales será la siguiente:
2.2.5.3.1 Intradermotuberculinización sencilla:
Positiva: reacción bovina positiva como la descrita en el párrafo c del apartado 2.2.5.2.
Dudosa: reacción dudosa como la descrita en el párrafo b del apartado 2.2.5.2.
Negativa: reacción bovina negativa como la descrita en el párrafo a del apartado 2.2.5.2.
Los animales en los que la intradermotuberculinización sencilla haya dado resultados dudosos serán sometidos a otra tuberculinización después de un plazo mínimo de 42 días.
Los animales en los que esta segunda prueba no dé resultados negativos se considerarán positivos.
Los animales en los que la intradermotuberculinización sencilla dé resultados positivos podrán someterse a una intradermotuberculinización de comparación si se sospecha la existencia de una reacción positiva falsa o una reacción de interferencia.
2.2.5.3.2 Intradermotuberculinización de comparación para la determinación y el mantenimiento de la calificación de explotación oficialmente libre de tuberculosis:
Positiva: reacción bovina positiva que sea superior en más de 4 mm a la reacción aviar, o presencia de signos clínicos.
Dudosa: reacción bovina positiva o dudosa que sea de 1 a 4 mm superior a la reacción aviar, y ausencia de signos clínicos.
Negativa: reacción bovina negativa, o reacción bovina positiva o dudosa pero que sea igual o inferior a una reacción aviar positiva o dudosa, y ausencia de signos clínicos en ambos casos.
Los animales en los que la intradermotuberculinización de comparación haya dado resultados dudosos deberán ser sometidos a otra tuberculinización transcurrido un plazo mínimo de 42 días.
Los animales en los que esta segunda prueba no dé resultados negativos se considerarán positivos.
2.2.5.3.3 La calificación de explotación oficialmente libre de tuberculosis podrá suspenderse y los animales procedentes de ella no podrán ser objeto de intercambios comerciales intracomunitarios mientras no se determine la calificación de los animales siguientes:
Animales que se hayan considerado dudosos en la intradermotuberculinización sencilla.
Animales que se hayan considerado positivos en la intradermotuberculinización sencilla, pero que deban someterse de nuevo a una prueba por intradermotuberculinización de comparación.
Animales que se hayan considerado dudosos en la intradermotuberculinización de comparación.
2.2.5.3.4 Cuando la legislación comunitaria exija que los animales se sometan a una intradermotuberculinización antes de su traslado, se interpretará la prueba para que ningún animal que muestre un aumento del grosor del pliegue de la piel superior a 2 mm o la presencia de signos clínicos sea objeto de intercambios comerciales intracomunitarios.
2.2.5.3.5 Para permitir la detección del máximo número de animales infectados o enfermos de una explotación o una región, los Estados miembros podrán modificar los criterios para la interpretación de la prueba con el fin de mejorar la sensibilidad de ésta considerando que todas las reacciones dudosas mencionadas en el párrafo b de los apartados 2.2.5.3.1 y 2.2.5.3.2 son reacciones positivas.
3. Pruebas suplementarias.
Para permitir la detección del máximo número de animales infectados o enfermos de una explotación o una provincia, podrá autorizarse el empleo de la prueba de interferón gamma a que se refiere el capítulo 2.3.3 (tuberculosis bovina) de la cuarta edición (2000) del Manual de normas para las pruebas de diagnóstico y las vacunas de la Oficina Internacional de Epizootias, además de la tuberculinización.
4. Laboratorio Nacional de Referencia.
Se designa al Laboratorio Central de Sanidad Animal (Laboratorio de Sanidad y Producción Animal) de Santa Fe (Granada), perteneciente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, como centro nacional de referencia para la tuberculosis en animales.
El Laboratorio Nacional de Referencia se encargará, sin perjuicio de lo dispuesto en los artículos 9, 11 y 14, de la comprobación oficial de las tuberculinas o los reactivos a que se refieren los apartados 2 y 3, dentro de España, para garantizar que se ajustan a las normas anteriormente mencionadas.
1. Identificación del agente.
La demostración, mediante tinción inmunoespecífica o ácido-resistente modificada, de la presencia de organismos con morfología de Brucella en material procedente de abortos, flujo vaginal o leche indica posibilidad de brucelosis, especialmente en caso de que dicha demostración se vea confirmada por resultados de pruebas serológicas.
Una vez aislados los microorganismos, deben identificarse la especie y el biovar mediante lisis por fagos o pruebas del metabolismo oxidativo y criterios de cultivo, bioquímicos y serológicos.
Las técnicas y medios utilizados, su normalización y la interpretación de los resultados deben ajustarse a lo dispuesto en los capítulos 2.3.1 (brucelosis bovina) y 2.4.2 (brucelosis caprina y ovina) de la cuarta edición de 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE.
2. Pruebas inmunológicas.
2.1 Patrones.
2.1.1 Para la preparación de todos los antígenos utilizados en las pruebas de rosa de Bengala, de aglutinación del suero, de fijación del complemento y del anillo en leche deberá utilizarse la cepa Weybridge 99 o la cepa USDA 1119-3 del biovar 1 de Brucella abortus.
2.1.2 El suero patrón de referencia para las pruebas arriba mencionadas es el suero patrón de referencia internacional de la OIE, anteriormente denominado segundo suero anti-Brucella abortus internacional de la OMS.
2.1.3 Los sueros patrón de referencia para las pruebas ELISA son los siguientes:
El suero patrón de referencia internacional de la OIE.
El suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE.
El suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE.
El suero patrón ELISA negativo de la OIE.
2.1.4 Los sueros patrón arriba mencionados pueden obtenerse en la Agencia de Laboratorios Veterinarios (Veterinary Laboratories Agency, VLA) de Weybridge (Reino Unido).
2.1.5 Los sueros patrón mencionados en el apartado 2.1.3 son patrones primarios internacionales de los cuales deben establecerse para cada prueba en cada Estado miembro patrones nacionales secundarios de referencia (en adelante, de trabajo).
2.2 Pruebas de inmunoabsorción enzimática (ELISA) u otras pruebas aglutinantes para la detección de la brucelosis bovina en suero o leche.
2.2.1 Material y reactivos.
La técnica empleada y la interpretación de los resultados deberán haberse validado de conformidad con los principios establecidos en el capítulo 1.1.3 de la cuarta edición de 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE y deberán incluir al menos estudios de laboratorio y de diagnóstico.
2.2.2 Normalización de la prueba.
2.2.2.1 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras individuales de suero:
Una pre-dilución al 1/150 (1) de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/2 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/16 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) debe dar reacción positiva.
Una pre-dilución al 1/600 de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/8 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/64 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) debe dar reacción negativa.
El suero patrón ELISA negativo de la OIE debe dar siempre reacción negativa.
2.2.2.2 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras mezcladas de suero:
Una pre-dilución al 1/150 de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/2 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/16 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) y diluida de nuevo en sueros negativos por el número de muestras que componen la mezcla debe dar reacción positiva.
El suero patrón ELISA negativo de la OIE debe dar siempre reacción negativa.
La prueba debe ser capaz de detectar indicios de infección en un solo animal del grupo de animales de los que se hayan mezclado muestras de suero.
2.2.2.3 Normalización del procedimiento de la prueba para muestras mezcladas de leche o de lactosuero:
Una pre-dilución al 1/1000 de suero patrón de referencia internacional de la OIE, una pre-dilución al 1/16 de suero patrón ELISA débilmente positivo de la OIE o una pre-dilución al 1/125 de suero patrón ELISA fuertemente positivo de la OIE realizada en un suero negativo (o en una mezcla de sueros negativos) y diluida de nuevo al 1/10 en leche negativa, debe dar reacción positiva.
El suero patrón ELISA negativo de la OIE diluido al 1/10 en leche negativa debe dar siempre reacción negativa.
La prueba debe ser capaz de detectar indicios de infección en un solo animal del grupo de animales de los que se hayan mezclado muestras de leche o de lactosuero.
2.2.3 Condiciones para el empleo de las pruebas ELISA en el diagnóstico de la brucelosis bovina:
2.2.3.1 Si se emplean las condiciones de calibración arriba mencionadas para las pruebas ELISA con muestras de suero, la sensibilidad de diagnóstico de las pruebas ELISA debe ser igual o superior a la de la prueba de rosa de Bengala o a la de la prueba de fijación del complemento, teniendo en cuenta la situación epidemiológica en la que se utilicen.
2.2.3.2 Si se emplean las condiciones de calibración arriba mencionadas para las pruebas ELISA con muestras de leche mezcladas, la sensibilidad de diagnóstico de las pruebas ELISA debe ser igual o superior a la de la prueba del anillo en leche, teniendo en cuenta no sólo la situación epidemiológica, sino también los sistemas de cría de ganado medios y extremos que cabe esperar.
2.2.3.3 Si las pruebas ELISA se emplean para la certificación de conformidad con el artículo 6.1 del Real Decreto 1716/2000, o para el establecimiento y mantenimiento del estatuto de un rebaño de conformidad con el punto 11 de la parte II del anexo I de dicho Real Decreto, debe llevarse a cabo una mezcla de muestras de suero de forma que los resultados de las pruebas puedan vincularse sin ningún género de dudas a los distintos animales incluidos en el conjunto. Toda prueba de confirmación debe llevarse a cabo con muestras de suero tomadas de animales por separado.
2.2.3.4 Las pruebas ELISA pueden utilizarse con una muestra de leche tomada de la leche recogida en una explotación con al menos un 30 % de vacas lecheras en fase de producción de leche. Si se emplea este método, deben aplicarse medidas a fin de que las muestras tomadas para su examen puedan vincularse sin ningún género de dudas a los distintos animales de los que procede la leche. Toda prueba de confirmación debe llevarse a cabo con muestras de suero tomadas de animales por separado.
2.3 Prueba de fijación del complemento (FdC).
2.3.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en solución salina de fenol [NaCl al 0,85 % (m/v) y fenol al 0,5 % (v/v)] o en solución amortiguadora de veronal. Los antígenos pueden presentarse en forma concentrada, siempre que en la etiqueta del frasco se indique el factor de dilución que debe utilizarse. El antígeno debe almacenarse a 4 ºC y no debe congelarse.
2.3.2 Los sueros deben inactivarse de la manera siguiente:
Suero bovino: a una temperatura de 56 a 60 ºC entre 30 y 50 minutos.
2.3.3 Con objeto de provocar la reacción genuina en el procedimiento de la prueba, se debe usar una dosis de complemento superior a la mínima necesaria para lograr una hemólisis completa.
2.3.4 Al realizar la prueba de fijación del complemento, deben efectuarse cada vez los controles siguientes:
Control del efecto anticomplementario del suero.
Control del antígeno.
Control de los hematíes sensibilizados.
Control del complemento.
Control de la sensibilidad al principio de la reacción, mediante un suero positivo.
Control de la especificidad de la reacción, mediante un suero negativo.
2.3.5 Cálculo de los resultados.
El suero patrón de referencia internacional de la OIE (OIEISS) contiene 1000 unidades internacionales de prueba FdC por mililitro. Si este suero patrón se somete a prueba mediante un método dado, el resultado se expresa como título (Toieiss). El resultado de la prueba con el suero problema, indicado como título (Tsuero problema), debe expresarse en unidades internacionales de prueba FdC por mililitro. El factor de conversión (F) necesario para pasar el título de un suero problema desconocido (Tsuero problema), examinado mediante dicho método, a su expresión en unidades internacionales de prueba FdC puede averiguarse mediante la siguiente fórmula:
| F = 1000 x 1 TOIEISS |
y el contenido de unidades internacionales de prueba FdC por mililitro de suero problema (UIPFdCsuero problema) mediante la siguiente:
| UIPFDCSUERO PROBLEMA = F X TSUERO PROBLEMA |
2.3.6 Interpretación de los resultados.
Se considera positivo un suero que contenga 20 o más unidades internacionales de prueba FdC por mililitro.
2.4 Prueba del anillo en leche.
2.4.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en solución salina de fenol [NaCl al 0,85 % (m/v) y fenol al 0,5 % (v/v)] marcada con hematoxilina. El antígeno debe almacenarse a 4 ºC y no debe congelarse.
2.4.2 La sensibilidad del antígeno debe estar normalizada en relación con el suero patrón de referencia internacional de la OIE, de forma que el antígeno dé reacción positiva con una dilución al 1/500 de este suero patrón en leche negativa, mientras que con una dilución al 1/1000 dé reacción negativa.
2.4.3 La prueba del anillo debe efectuarse con muestras que representen el contenido de cada cántara o de cada cisterna de la explotación.
2.4.4 Las muestras de leche no deben haberse congelado, calentado ni sometido a fuerte agitación.
2.4.5 La reacción debe llevarse a cabo utilizando uno de los métodos siguientes:
Con una columna de leche de al menos 25 mm de altura y con un volumen de leche de 1 ml al que se hayan añadido 0,03 ml o 0,05 ml de uno de los antígenos marcados normalizados.
Con una columna de leche de al menos 25 mm de altura y con un volumen de leche de 2 ml al que se hayan añadido 0,05 ml de uno de los antígenos marcados normalizados.
Con un volumen de leche de 8 ml al que se hayan añadido 0,08 ml de uno de los antígenos marcados normalizados.
2.4.6 La mezcla de leche y antígenos debe incubarse a 37 ºC durante 60 minutos, junto con patrones de trabajo negativo y positivo. La sensibilidad de la prueba aumenta si se prorroga la incubación a 4 ºC durante un período de entre 16 y 24 horas.
2.4.7 Interpretación de los resultados:
Reacción negativa: leche coloreada, nata incolora.
reacción positiva:
Leche y nata de idéntico color.
O leche incolora y nata coloreada.
2.5 Prueba de rosa de Bengala en placa.
2.5.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en diluyente de antígeno de brucela tamponado a un pH de 3,65 ± 0,05, marcado con el colorante rosa de Bengala. El antígeno debe suministrarse listo para su uso, debe almacenarse a 4 ºC y no debe congelarse.
2.5.2 El antígeno no se prepara en función de la concentración celular, sino que su sensibilidad debe normalizarse con relación al suero patrón de referencia internacional de la OIE de forma que el antígeno dé reacción positiva con una dilución de suero al 1/45 y reacción negativa con una dilución al 1/55.
2.5.3 La prueba de rosa de Bengala en placa debe realizarse de la manera siguiente:
Se mezclan 20-30 µl de suero con un volumen igual de antígeno en una placa blanca de porcelana o de esmalte para obtener una zona con un diámetro de 2 cm, aproximadamente. La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente, tras lo que se observa con buena iluminación para ver si se ha producido aglutinación.
Se puede utilizar un método automatizado, pero debe ser al menos tan sensible y exacto como el método manual.
2.5.4 Interpretación de los resultados.
Toda reacción visible debe considerarse positiva, a menos que se observe un exceso de sequedad alrededor de los bordes.
En cada serie de pruebas deben incluirse patrones de trabajo positivos y negativos.
2.6 Prueba de aglutinación del suero.
2.6.1 El antígeno consiste en una suspensión bacteriana en una solución salina de fenol [NaCl al 0,85 % (m/v) y fenol al 0,5 % (v/v)]. No debe utilizarse formaldehído.
Los antígenos pueden presentarse en forma concentrada, siempre que en la etiqueta del frasco se indique el factor de dilución que debe utilizarse.
Se puede añadir EDTA a la suspensión de antígeno hasta alcanzar una dilución final de prueba de 5 mM para reducir el nivel de falsos positivos en la prueba de aglutinación del suero. Posteriormente, se debe reajustar el pH de 7,2 en la suspensión de antígeno.
2.6.2 El suero patrón de referencia internacional de la OIE contiene 1000 unidades internacionales de aglutinación.
2.6.3 El antígeno no se prepara en función de la concentración celular, sino que su sensibilidad debe normalizarse con relación al suero patrón de referencia internacional de la OIE de forma que el antígeno produzca una aglutinación del 50 % con una dilución final del suero entre el 1/600 y el 1/1000, o una aglutinación del 75 % con una dilución final del suero entre el 1/500 y el 1/750.
También puede resultar recomendable comparar la reactividad entre lotes de antígeno nuevos y lotes de antígeno normalizados anteriormente utilizando un grupo de sueros definidos.
2.6.4 La prueba se realiza en tubos o en microplacas. La mezcla de antígeno y diluciones de suero debe incubarse durante un período de 16 a 24 horas a 37 ºC.
De cada suero deben prepararse al menos tres diluciones. Las diluciones de suero sospechoso deben realizarse de forma que la lectura de la reacción al límite de positividad se realice en el tubo intermedio (o en el pocillo intermedio en el caso del método de las microplacas).
2.6.5 Interpretación de los resultados.
El grado de aglutinación de Brucella en un suero debe expresarse en UI/ml.
Se considera positivo un suero que contenga 30 o más UI/ml.
3. Pruebas complementarias.
3.1 Prueba cutánea de la brucelosis.
3.1.1 Condiciones para el empleo de esta prueba:
La prueba cutánea de la brucelosis no debe emplearse para fines de certificación en el comercio intracomunitario.
Esta prueba es una de las más específicas para la detección de la presencia de brucelosis en animales no vacunados; no obstante, no se debe realizar el diagnóstico únicamente a partir de reacciones intradérmicas positivas.
Debe considerarse que están infectados los animales de la especie bovina que se hayan sometido a una de las pruebas serológicas definidas en este anexo con un resultado negativo y que reaccionen positivamente a la prueba cutánea de la brucelosis.
Los animales de la especie bovina que se hayan sometido a una de las pruebas serológicas definidas en este anexo con un resultado positivo pueden someterse a una prueba cutánea de la brucelosis para confirmar la interpretación de los resultados de las pruebas serológicas, especialmente cuando no pueda excluirse una reacción cruzada con anticuerpos de otras bacterias en el caso de los rebaños indemnes de brucelosis u oficialmente indemnes de brucelosis.
3.1.2 La prueba debe llevarse a cabo mediante un preparado alergénico de la brucelosis normalizado y definido que no contenga lipopolisacárido liso antigénico, ya que éste puede provocar reacciones inflamatorias inespecíficas o interferir con pruebas serológicas posteriores.
Un preparado de tales características es la brucelina INRA, que procede de una cepa no lisa de B. melitensis. Sus condiciones de producción aparecen descritas detalladamente en la sección B2 del capítulo 2.4.2 de la cuarta edición de 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE.
3.1.3 Procedimiento de la prueba.
3.1.3.1 Se inyecta por vía intradérmica un volumen de 0,1 ml de alergeno de la brucelosis en el pliegue caudal, en la piel de la ijada o en un lado del cuello.
3.1.3.2 La prueba se lee una vez transcurridas de 48 a 72 horas.
3.1.3.3 Antes de la inyección y en el momento de la lectura, se mide con un pie de rey el grosor de la piel en el lugar de la inyección.
3.1.3.4 Interpretación de los resultados.
Las reacciones fuertes se reconocen fácilmente por la inflamación y la induración locales.
Se considera que la reacción a la prueba cutánea de la brucelosis es positiva si se produce un aumento del grosor de la piel de 1,5 a 2 mm.
3.2 Prueba de inmunoabsorción enzimática de competición (ELISAc).
3.2.1 Condiciones para el empleo de esta prueba:
La ELISAc no debe emplearse con fines de certificación en el comercio intracomunitario.
La ELISAc ha mostrado tener mayor especificidad que, por ejemplo, la ELISA indirecta, y por consiguiente puede usarse para confirmar la interpretación de los resultados de las pruebas serológicas.
3.2.2 Procedimiento de la prueba.
La prueba debe realizarse de acuerdo con el párrafo a del apartado 2 del capítulo 2.3.1 de la cuarta edición de 2000 del Manual de normas para pruebas de diagnóstico y vacunas de la OIE.
4. Laboratorio Nacional de Referencia.
4.1 El Laboratorio Central de Sanidad Animal (Laboratorio de Sanidad y Producción Animal) de Santa Fe (Granada), Camino del Jau s/n, 18320, es el designado como Laboratorio Nacional de Referencia para la brucelosis en animales.
4.2 Tareas y responsabilidades. Las tareas y responsabilidad del Laboratorio Nacional de Referencia, sin perjuicio de lo dispuesto en los artículos 9, 11 y 14 y en la disposición transitoria cuarta, son las siguientes:
Aprobación de los resultados de los estudios de validación que demuestren la fiabilidad del método de prueba utilizado en España.
Determinación del número máximo de muestras que deben mezclarse en las baterías de ELISA utilizadas.
Calibración de los sueros patrón nacionales secundarios de referencia (patrones de trabajo) frente al suero patrón primario internacional mencionado en el apartado 2.1.
Controles de calidad de todos los lotes de antígenos y de baterías de ELISA utilizados en España.
Cooperación dentro de la red de laboratorios nacionales de referencia para la brucelosis de la Unión Europea.
(1) A efectos de este anexo, las diluciones para preparar los reactivos líquidos se expresan, por ejemplo, como 1/150, lo que indica una dilución de 1 en 150.
1. La detección de la leucosis enzoótica bovina se realizará mediante la prueba de inmunodifusión, en las condiciones descritas en las letras A y B, o mediante la prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) en las condiciones descritas en la letra C. El método de inmunodifusión sólo se aplicará en las pruebas individuales.
A. Prueba de inmunodifusión en gel de agar.
El antígeno que habrá de utilizarse en esta prueba deberá contener glicoproteínas del virus de la leucosis bovina. El antígeno deberá estar contrastado en relación con un suero patrón (suero E1) suministrado por el Statens Veterinaere Serum Laboratorium de Copenhague.
Los antígenos patrón utilizados en el laboratorio deberán ser presentados, por lo menos una vez al año, en el laboratorio de referencia, para someterlos a prueba en relación con el suero patrón CEE. Independientemente de esta valoración, el antígeno utilizado podrá ser controlado con arreglo a lo dispuesto en la letra B.
La prueba aplicará los reactivos siguientes:
Antígeno: El antígeno deberá contener glicoproteínas específicas del virus de la leucosis enzoótica bovina que haya sido contrastado respecto al suero oficial CEE.
El suero para prueba.
Un suero de control positivo conocido.
Gel de agar: 0,8 % de agar, 8,5 % de NaCl, Tampón Tris 0,05 M, pH 7,2.
Deberán introducirse 15 mililitros de gel de agar en una placa de Petri de 85 milímetros de diámetro, lo que dará una profundidad de 2,6 milímetros de gel.
Se deberá hacer una red experimental de siete pocillos exentos de humedad mediante perforación del agar hasta el fondo de la placa; dicha red consistirá en un pocillo central alrededor del cual se ordenarán seis pocillos periféricos dispuestos en círculo.
Diámetro del pocillo central: 4 milímetros.
Diámetro de los pocillos periféricos: 6 milímetros.
Distancia entre el pocillo central y los periféricos: 3 milímetros.
Se deberá llenar de antígeno patrón el pocillo central. Los pocillos periféricos 1 y 4 (ver esquema anterior) se llenarán con el suero positivo conocido y los pocillos 2, 3, 5 y 6 con los (aquí croquis) sueros de prueba. Los pocillos deberán llenarse hasta la desaparición del menisco.
Las cantidades añadidas serán las siguientes:
Antígeno: 32 microlitros,
Suero de control: 73 microlitros,
Suero de prueba: 73 microlitros.
La incubación deberá durar setenta y dos horas a temperatura ambiente (20-27 ºC) en un recinto húmedo cerrado.
La prueba podrá leerse veinticuatro y cuarenta y ocho horas después, pero no se podrá obtener ningún resultado final antes de transcurridas setenta y dos horas:
Un suero de prueba será positivo si forma una curva de precipitación específica con el antígeno del virus de la leucosis bovina y si dicha curva coincide con la del suero de control.
Un suero de prueba será negativo si no da una curva de precipitación específica con el antígeno del virus de la leucosis bovina y si no desvía la curva del suero de control.
La reacción no podrá considerarse concluyente si:
El suero desvía la curva del suero de control hacia el pocillo del antígeno del virus de la leucosis bovina sin formar una curva de precipitación visible con el antígeno.
No es posible interpretarla como negativa ni como positiva.
En caso de reacciones dudosas, podrá repetirse la prueba y utilizar suero concentrado.
Podrá utilizarse cualquier otra configuración o red de oquedades siempre que el suero E4, en una dilución a 1:10 en suero negativo, pueda ser detectado como positivo.
B. Método de valoración del antígeno.
Soluciones y materiales necesarios:
40 mililitros de gel de agar de 1,6 % en un tampón Tris 0,05 M/HCL de pH 7,2, con 8,5 % de NaCl.
15 mililitros de un suero de la leucosis bovina que sólo contenga anticuerpos respecto a las glicoproteínas del virus de la leucosis bovina, diluido al 1:10 en un tampón Tris 0,05 M/HCL de pH 7,2 con 8,5 % de NaCl.
15 mililitros de un suero de la leucosis bovina que sólo contenga anticuerpos respecto a las glicoproteínas del virus de la leucosis bovina, diluido a 1:5 en un tampón Tris 0,05 M/HCL de pH 7,2 con 8,5 % de NaCl.
Cuatro placas de Petri de plástico de un diámetro de 85 milimetros.
Un punzón de un diámetro de 4 a 6 milimetros.
Un antígeno de referencia.
El antígeno que haya de valorarse.
Un baño de agua (56 ºC).
Procedimiento:
Disolver el gel (1,6 %) en el tampón Tris/HCL calentando con precaución hasta 100 ºC. Colocar en el baño de agua a 56ºC durante una hora aproximadamente. Colocar además las soluciones del suero de la leucosis bovina en el baño de agua a 56 ºC.
Mezclar a continuación 15 ml de la solución de gel a 56 ºC con los 15 mililitros de suero de la leucosis bovina (1:10), agitar rápidamente y verter en dos placas de Petri, a razón de 15 mililitros por placa.
Repetir el procedimiento con suero de la leucosis bovina diluido a 1:15.
Cuando el gel de agar haya endurecido, se practicarán los agujeros de la forma siguiente:
Adicción de antígenos:
Placas de Petri números 1 y 3:
Antígeno de referencia, no diluido.
Antígeno de referencia, diluido al 1/2.
+E: Antígenos de referencia.
Antígeno a testar, no diluido.
Placas de Petri números 2 y 4:
Antígeno a testar, no diluido.
Antígeno a testar, diluido al 1/2.
Antígeno a testar, diluido al 1/4.
Antígeno a testar, diluido al 1/8.
Instrucciones complementarias:
El experimento deberá realizarse con dos grados de dilución del suero (1:5 y 1:10), a fin de obtener la precipitación óptima.
Si el diámetro de precipitación fuere excesivamente débil con los dos grados de dilución, el suero deberá ser objeto de una dilución suplementaria.
Si el diámetro de precipitación fuere excesivo para los dos grados de dilución y si el precipitado desapareciese, se deberá escoger un grado más débil de dilución para el suero.
La concentración final del gel deberá establecerse en 0,8 %, y la de los sueros en 5 % y en 10 %, respectivamente.
Anotar los diámetros medidos en el sistema coordinado siguiente. La dilución de trabajo será aquella en la que se registre el mismo diámetro para el antígeno de prueba que para el antígeno de referencia.
C. Prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA) para la detección de la leucosis enzoótica bovina.
Los materiales que habrán de utilizarse en el método ELISA son los siguientes:
Microplacas de fase sólida, platillos o cualquier otra fase sólida.
El antígeno se fijará a la fase sólida con o sin ayuda de anticuerpos captores policlonales o monoclonales. Si el antígeno se asocia directamente a la fase sólida, todas las muestras de ensayo que den reacciones positivas deberán someterse a nuevas pruebas con el antígeno de control en el caso de la leucosis enzoótica bovina. El antígeno de control deberá ser idéntico al antígeno examinado, excepto en el caso de los antígenos VLB (virus de la leucosis bovina). Si los anticuerpos captores están asociados a la fase sólida, los anticuerpos sólo deben reaccionar ante antígenos VLB.
El líquido biológico que se vaya a examinar.
Un control positivo y otro negativo.
Un conjugado.
Un substrato adaptado a los enzimas utilizados.
En caso necesario, una solución de interrupción.
Soluciones para la dilución de las muestras de ensayo, para las preparaciones de reactivos y para el lavado.
Un sistema de lectura que corresponda al substrato utilizado.
Normalización y sensibilidad de la prueba.
La sensibilidad de la prueba ELISA deberá ser de un nivel tal que el suero E4 dé positivo tras diluirse 10 veces (muestras de suero) o 250 veces (muestras de leche) más que la dilución obtenida a partir de muestras individuales puestas en común. En ensayos en los que las muestras (suero y leche) sean sometidas a pruebas por separado, el suero E4 diluido en una proporción de 1 a 10 (suero negativo) o 1:250 (leche negativa) deberá dar positivo cuando se someta a la prueba en la misma dilución de ensayo utilizada para las pruebas individuales. El Laboratorio Nacional de Referencia será responsable del control de la calidad del método ELISA y, en particular, de determinar, en función del título obtenido con el suero E4, el número de muestras que pueden mezclarse en cada lote de producto.
El laboratorio veterinario nacional de Copenhague suministrará el suero E4.
Condiciones de utilización de la prueba ELISA para la detección de la leucosis enzoótica bovina.
El método ELISA podrá aplicarse a una muestra de leche o lactosuero tomada de la leche procedente de una explotación donde al menos un 30 % de las vacas estén en período de lactación.
Cuando se utilice este método, deberán adaptarse medidas que garanticen la relación entre las muestras tomadas, los animales de los que procedan la leche o los sueros que se examinan.
D. Laboratorio Nacional de Referencia.
El Laboratorio de Sanidad y Producción Animal de Algete (Madrid) perteneciente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, es el designado como Centro Nacional de Referencia para leucosis enzoótica bovina.
A. Reacción de fijación del complemento de Campbell y Turner para la detección de anticuerpos en muestras de suero sanguíneo.
Se trata de una técnica de fijación de complemento en caliente que requiere los siguientes elementos:
Sistema hemolítico obtenido por la mezcla de volúmenes iguales de un suero hemolítico que contiene 12 unidades hemolíticas 50 % y una suspensión de hematíes de carnero al 6 %.
Solución de complemento de cobaya que contiene 2,5 unidades.
Solución de antígeno de Campbell y Turner que contiene dos unidades.
Diluciones de los sueros en prueba (1/10, 1/20, etcétera).
Los sueros deben ser inactivados como se detalla en el apartado 3 de la sección B del anexo 2 del presente Real Decreto.
Cada vez que se realice la prueba se efectuarán los siguientes controles:
Control del efecto anticomplementario del suero.
Control del antígeno.
Control del sistema hemolítico.
Control del complemento de cobaya.
Control, con la ayuda de un suero positivo, de la sensibilidad al desencadenamiento de la reacción.
Control, con la ayuda de un suero negativo, de la especificidad.
Criterio de interpretación:
Se considerará positivo todo suero que diluido a 1/10 fije completamente el complemento (1/10++++).
Los sueros que diluidos a 1/10 fijen parcialmente el complemento, se considerarán sospechosos.
El suero patrón positivo a la prueba de Reacción de Fijación de Complemento de Campbell y Turner será preparado por el Centro Nacional de Referencia de micoplasmosis animales, de acuerdo con las recomendaciones del Laboratorio Europeo de Referencia.
B. Centro Nacional de Referencia.
El Laboratorio de Sanidad y Producción Animal de Santa Fe (Granada), perteneciente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, es el designado como Centro Nacional de Referencia para las microplasmosis animales.
La detección de la brucelosis (B. melitensis) se efectuará por medio de la prueba rosa bengala o por medio de la prueba de fijación del complemento que se describe a continuación o por cualquier otro método reconocido con arreglo al procedimiento comunitario previsto.
A. Prueba del antígeno brucelar tamponado.
La prueba rosa bengala pueda ser utilizada como prueba de serodiagnóstico en las explotaciones de animales de las especies ovina o caprina con el fin de concederles el título de explotación oficialmente indemne o indemne de brucelosis.
En caso de utilizar para la detección de brucelosis (brucella melitensis) la prueba de rosa bengala y obtener más de un 5 % de los animales de la explotación con reacción positiva, se efectuará un control complementario de cada animal de la explotación mediante una prueba de fijación del complemento.
Método manual:
El suero patrón es el segundo suero patrón internacional antibrucella abortus suministrado por el Laboratorio Central Veterinario de Weybridge, Surrey, Inglaterra.
El antígeno se preparará sin referencia a la concentración celular, pero su sensibilidad debe ser contratada en relación con el suero patrón internacional de manera que el antígeno produzca una reacción positiva para una dilución de suero de 1:47,5 y una reacción negativa para una dilución de 1:55.
El antígeno tamponado a pH 3,65 ± 0,5 y coloreado con rosa bengala.
Para preparar el antígeno se utilizará la cepa número 99 Weybridge a la cepa USDA 1119 u otra cepa de sensibilidad equivalente.
El antígeno será testado frente a ocho sueros liofilizados identificados como positivos y negativos.
La prueba deberá realizarse de la forma siguiente:
Poner una gota (0,03 ml) de antígeno y una gota (0,03 ml) de suero sobre una placa blanca.
Con la ayuda de un agitador proceder a la mezcla.
Agitar a continuación la placa con movimientos alternativos de delante a atrás (alrededor de 10 movimientos por minuto, durante cuatro minutos).
Efectuar la lectura bajo luz suficiente; en ausencia de aglutinación la prueba se considerará como negativa; toda aglutinación permite considerar la prueba como positiva a menos que se haya producido un secado excesivo sobre los bordes.
Método automático:
El método automático deber tener al menos igual sensibilidad y precisión que el método manual.
B. Reacción de fijación de complemento.
El suero patrón contendrá por milímetro 1.000 unidades sensibilizadoras; estas unidades se denominan unidades sensibilizadoras CEE.
La tasa de anticuerpos fijadores de complemento en un suero se expresará en unidades CEE.
Los sueros deben ser inactivados de 56 a 60 ºC durante treinta a cincuenta minutos.
Para la preparación de antígeno se utilizarán las copas Weybridge número 99 y USDA 1119.
Cuando se efectúe la reacción de fijación de complemento, es necesario proceder cada vez a los controles siguientes:
Control del efecto anticomplementario del suero.
Control del antígeno.
Control de los hematíes sensibilizados.
Control de complemento.
Control con la ayuda de un suero positivo, de la sensibilidad al desencadenamiento de la reacción.
Control de la especificidad de la reacción con la ayuda de un suero negativo.
C. Criterios de interpretación.
La prueba de fijación del complemento queda reservada para las pruebas efectuadas individualmente a los animales. la prueba de fijación del complemento podrá ser utilizada en las explotaciones de animales de las especies ovina o caprina con el fin de concederlas al título de explotación oficialmente indemne o indemne de brucelosis.
Para la prueba de fijación del complemento, se considerará positivo al suero que contenga como mínimo 20 unidades UCE por mililitro.
Todas las pruebas se realizarán a solicitud del titular de la explotación de precebo o cebadero, corriendo de su cargo el coste de su realización.
La obtención, mantenimiento, suspensión, recuperación o retirada del estatuto de explotación de precebo o cebadero calificados se regirá por lo dispuesto en los apartados I y II del anexo I del Real Decreto 1716/2000, de 13 de octubre, para el ganado vacuno, y en el capítulo I o el capítulo II del anexo A del Real Decreto 2121/1993, de 3 de diciembre, para el ovino o caprino, con las siguientes especialidades:
Para la obtención del título, en el ganado vacuno, será preciso que la explotación se componga exclusivamente con animales procedentes de rebaños oficialmente indemnes de tuberculosis, oficialmente indemnes de brucelosis y oficialmente indemnes de leucosis enzoótica bovina, y que tras su composición se hayan realizado las pruebas previstas en el citado anexo I del Real Decreto 1716/2000, de 13 de octubre, con resultado favorable.
Para el mantenimiento del título, las pruebas efectuadas para la obtención del título tendrán una validez de un año a los efectos de la realización de las pruebas anuales exigidas dentro de los programas nacionales de erradicación de la tuberculosis y la brucelosis bovina, o de la brucelosis ovina y caprina, que se ejecutan en la comunidad autónoma correspondiente.
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